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                                                                                          Dott. Carlo Sebastiano Tadeo
                                                                                                Specialista Neurologia

Neuropatie

 

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Gruppo di Lavoro ad hoc del Gruppo di Studio del Sistema Nervoso Periferico:

Vittorio CRESPI, neurologo esperto in bioetica, Ospedale di Vimercate (MI)
Gian Maria FABRIZI, neurologo esperto in biologia molecolare, Università di Verona
Paola MANDICH, genetista medico, Università di Genova
Davide PAREYSON, neurologo clinico, Istituto Nazionale Neurologico "C. Besta", Milano
Fabrizio SALVI, neurologo clinico, Università di Bologna
Lucio SANTORO, neurofisiologo clinico, Università Federico II di Napoli
Angelo SCHENONE, neurologo clinico esperto in neuropatologia, Università di Genova
Franco TARONI, neurologo esperto in genetica molecolare, Istituto Nazionale Neurologico "C . Besta", Milano

PROCEDURE DIAGNOSTICHE PER LE NEUROPATIE EREDITARIE

Le neuropatie ereditarie costituiscono un gruppo di malattie di comune riscontro nella pratica clinica: la Malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) ha una prevalenza elevata, stimata in 1:2,500,23,25 ed è una tra le più frequenti patologie ereditarie. I recenti e continui avanzamenti nel campo della genetica molecolare ne hanno modificato radicalmente l'approccio clinico. Il difetto genetico in alcuni casi rientra addirittura nella definizione diagnostica della neuropatia (es. malattia di Charcot-Marie-Tooth tipo 1A, da alterazioni del cromosoma 17p) e comunque l'indagine genetico-molecolare fa ormai parte del corredo diagnostico delle neuropatie periferiche. Si è quindi ritenuto utile riassumere le informazioni necessarie per un approccio ordinato e razionale alla diagnosi delle neuropatie ereditarie, per una corretta utilizzazione di uno strumento diagnostico sofisticato quale l’analisi molecolare, e per evitare esami inutili e dispendiosi.

L’argomento delle presenti linee guida è quindi costituito dal processo diagnostico della Malattia di Charcot-Marie-Tooth e delle Neuropatie correlate (la neuropatia ereditaria con predisposizione alle paralisi da compressione [HNPP] e la malattia di Dèjèrine-Sottas [DSS]) con particolare riferimento al ruolo delle indagini genetico-molecolari. L’obiettivo è di chiarire: (a) quando e come tali esami vadano richiesti nell’iter diagnostico delle neuropatie in oggetto; (b) le informazioni che i test genetici sono in grado di fornire; (c) quali siano le diverse metodiche e il loro grado di affidabilità.

La scelta di queste neuropatie è dettata dalle seguenti ragioni: (a) sono complessivamente le più frequenti, (b) sono geneticamente diagnosticabili, e (c) hanno un iter diagnostico simile.

L’iter diagnostico proposto prevede, oltre agli esami genetici, la valutazione clinica, neurofisiologica ed eventualmente neuropatologica del paziente.

Destinatari iniziali di queste linee guida sono i neurologi e i genetisti medici.

CRITERI DIAGNOSTICI - TERMINOLOGIA e DEFINIZIONI

Con l’acronimo inglese HMSN (Hereditary Motor and Sensory Neuropathy) si indica l’insieme delle neuropatie ereditarie sensitivo-motorie. La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) tipo 1 e tipo 2 corrispondono alla HMSN I e II; la malattia di Dèjèrine-Sottas (DSS) corrisponde alla HMSN III. In questa sede, tuttavia, utilizzeremo gli eponimi in quanto prevalenti nella letteratura anche recente.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT):11-13,17,18,20,32 E’ la più frequente neuropatia periferica ereditaria (prevalenza 1:2.500). E’ caratterizzata da: ipotrofia e debolezza muscolare prevalentemente localizzata a livello distale degli arti inferiori (distribuzione peroneale), simmetrica, a decorso lentamente progressivo, generalmente accompagnata da ipo/areflessia osteotendinea, ipoestesia superficiale e profonda, piede cavo e dita a martello.

Ereditarietà: autosomica dominante, X-linked dominante, eccezionalmente autosomica recessiva. Relativamente frequente è l’evenienza di mutazioni di nuova insorgenza (mutazioni de novo).19,26

E’ suddivisa in:

CMT1 : forma demielinizzante con riduzione delle Velocità di Conduzione Motorie (VCM) a £ 38 m/sec agli arti superiori (n. mediano) e fenomeni di demielinizzazione e rimielinizzazione segmentaria con "onion bulbs" alla biopsia del nervo periferico.12,13,17,18 E’ il sottotipo più frequente (rappresenta circa i 2/3 dei casi di CMT).18,20,25

CMT2 : forma assonale, VCM relativamente conservate (³ 38 m/sec agli arti superiori), sofferenza assonale cronica alla biopsia (rappresenta circa il 20-30% dei casi di CMT).12,13,17,18,20,25

Ulteriore suddivisione in base alla localizzazione cromosomica e ai geni coinvolti:

CMT1. E’ suddivisa in:

CMT1A,3,6,7,13,23,37 associata ad alterazioni nella regione cromosomica 17p11.2-12 che contiene il gene della Proteina della Mielina Periferica 22 (PMP22): duplicazione di 1.5 megabasi22,31 (frequenza = 68-90% dei casi di CMT1)11,17,26,42 o mutazioni puntiformi nel gene PMP22 (frequenza = 1%);26

CMT1B, associata a mutazioni nel gene della proteina della mielina P0 (MPZ) sul cromosoma 1q22 (frequenza = 4%).11,17,26,32

Esiste sicuramente almeno un altro locus cromosomico, per cui si parla di CMT1C per le famiglie nelle quali è esclusa un’associazione della malattia con i loci 17p e 1q (frequenza ignota).11,13,32

CMTX: cr. Xq13-22, associata a mutazioni del gene della connessina 32 (Cx32).11,13,17,32 Un tempo ritenuta rara, potrebbe rappresentare sino al 20% delle forme di CMT in generale.20 Si caratterizza per l’assenza di trasmissione da maschio a maschio. Fenotipo clinico più grave nei maschi rispetto alle femmine (queste ultime possono anche essere asintomatiche). Alterazioni elettrofisiologiche più marcate nei maschi con aspetti prevalentemente demielinizzanti (VCM comprese tra 18 e 40 m/sec), più lieve nelle femmine con aspetti prevalenti di neuropatia assonale (range delle VCM più simile a quello della CMT2 = 25-61 m/sec).4,27 Biopsia nervosa: a differenza della CMT1 reperti generalmente suggestivi di prevalente sofferenza assonale.34

CMT2: nessuna mutazione in singoli geni è stata finora identificata; suddivisione, in base a studi di linkage, in :

CMT2A cr. 1p36. CMT2B cr. 3q13-22. CMT2C locus non identificato, caratterizzata clinicamente da interessamento di corde vocali e diaframma. CMT2D cr. 7p14.11,32

Esiste anche la forma spinale o neuronale (CMT spinale o neuronale o HMN distale - Hereditary Motor Neuropathy): fenotipo clinico simile, interessamento esclusivamente motorio distale (rientra tra le malattie del II motoneurone ad espressione distale).11-13,17 E’ stato riportato linkage con il cromosoma 12q24 in una singola famiglia.36

Sotto la sigla CMT4 sono raccolte le rare forme di CMT ad eredità autosomica recessiva.11,30,32 Comprendono: CMT4A, forma demielinizzante rara e severa osservata in Tunisia, in linkage con il cromosoma 8q13-21.1; è descritta anche una forma che mappa sul cromosoma 5q23-33. CMT4B, forma demielinizzante, descritta anche in Italia, caratterizzata da una peculiare alterazione neuropatologica della mielina (myelin outfoldings); è geneticamente eterogenea, essendo stato dimostrato in una famiglia, ma escluso in un’altra, il linkage con il cromosoma 11q13. CMT4C, forma assonale, nessun locus identificato.

HNPP:5,7,11,16,17,23,26,32,38,41 Neuropatia caratterizzata: clinicamente da deficit sensorimotori acuti, tipicamente non dolorosi, transitori e ricorrenti, scatenati da traumi o compressioni di lieve entità o senza causa apparente; elettrofisiologicamente da alterazioni della conduzione nervosa più evidente ai comuni siti di entrapment; neuropatologicamente da ispessimenti focali della mielina (tomacula). Ereditarietà: autosomica dominante, associata a delezione di 1.5 megabasi della regione 17p11.2. Rari casi senza delezione 17p11.2, eccezionalmente riportate mutazioni nel gene PMP22.

Da sottolineare la presenza di eterogeneità fenotipica con manifestazioni diverse dal punto di vista clinico (soggetti asintomatici, episodi acuti unici o multipli, mononeuropatie acute, plessopatia brachiale acuta, polineuropatia cronica, presentazione simile alla CMT), elettrofisiologico (velocità di conduzione normali con alterazioni limitate ai siti di entrapment, velocità di conduzione diffusamente rallentate), e perfino morfologico (assenza o scarsità di tomacula). Prevalenza: ignota, molto probabilmente sottodiagnosticata.

Malattia di Dèjèrine-Sottas (DSS; HMSN III):11,13,17,29 sotto questa definizione possono essere raccolte le varianti demielinizzanti gravi ad esordio precoce. Criteri generali diagnostici: esordio entro i due anni di età, grave compromissione motoria frequentemente anche prossimale, gravi deficit sensitivi con atassia, malformazioni scheletriche importanti (piede cavo e scoliosi); marcata riduzione delle velocità di conduzione nervose (£ 12 m/sec); quadro neuropatologico di grave ipo-demielinizzazione con "onion bulbs" formati perlopiù da lamina basale. Nella grande maggioranza dei casi si tratta di casi sporadici. Le mutazioni finora identificate coinvolgono i geni PMP22 e P0 (MPZ) (gli stessi associati alla CMT1A e CMT1B), sono perlopiù in forma eterozigote e di nuova insorgenza (de novo), e pertanto ad ereditarietà autosomica dominante.

Ipomielinizzazione congenita (CH):13,17,29,40 è una condizione estremamente rara e mal definita dal punto di vista nosologico. Si tratta di una neuropatia congenita con ipotonia, a volte artrogriposi, gravissima ipostenia che può portare a morte precocemente. Le fibre nervose periferiche sono prive di mielina o gravemente ipomielinizzate. Occasionalmente descritte mutazioni nel gene P0.

Nota: recentemente in alcuni casi di neuropatie ereditarie di tipo ipomielinizzante e demielinizzante (CMT1 inclusa) sono state identificate mutazioni dominanti e recessive nel gene EGR2,40 che si aggiunge quindi all’elenco dei geni associati a questo gruppo di neuropatie. Lo spettro fenotipico delle neuropatie associate a mutazioni di questo gene è oggetto di studio.

QUANDO, PERCHE’ E COME ATTIVARE LA DIAGNOSI GENETICA

La ricerca della duplicazione 17p11.2 (CMT1A) e della delezione 17p11.2 (HNPP) sono esami genetici attualmente utilizzabili a fini diagnostici e pertanto la discussione verte principalmente sulle indicazioni a questi due esami. La ricerca di mutazioni nei geni PMP22, P0 (MPZ) e Cx32 (e EGR2) non è ancora da considerare parte della diagnostica di routine.

APPROCCIO DIAGNOSTICO ALLE NEUROPATIE EREDITARIE

A) DEFINIZIONE CLINICA

primo dato importante è l'accertamento degli elementi clinici che possono orientare la diagnosi nell'ambito delle neuropatie ereditarie (CMT, HNPP, DSS) perché diverso può essere l'iter successivo.

B) RICERCA DELLA FAMILIARITA’

secondo dato importante è cercare di stabilire le modalità di ereditarietà:

– Trasmissione dominante:

– autosomica dominante (maggior parte dei casi di CMT; HNPP);

– dominante legata al cromosoma X (CMTX).

– Trasmissione autosomica recessiva (casi eccezionali di CMT)

– Casi sporadici (maggior parte dei casi di DSS, ma anche casi di CMT e HNPP di nuova insorgenza).

E' necessario tenere presente che in malattie ad espressione molto variabile come la CMT e l'HNPP è frequente l'evenienza di familiari apparentemente asintomatici ma in realtà affetti e quindi l'albero genealogico può considerarsi completo e sicuro solo dopo aver esaminato i soggetti a rischio con esame neurologico (e possibilmente con quello elettrofisiologico).

Quando sia stata identificata una forma potenzialmente familiare di neuropatia deve essere fornita al paziente ed alla sua famiglia una adeguata consulenza genetica.

C) INDAGINI STRUMENTALI SUL PROBANDO

La terza fase consiste nel completamento delle indagini nel soggetto in questione (probando).

L'ESAME ELETTROFISIOLOGICO

Le indagini neurofisiologiche sono fondamentali nell’iter diagnostico di un paziente con sospetto di malattia di Charcot-Marie-Tooth e neuropatie ereditarie correlate: consentono il corretto inquadramento fisiopatologico, orientano la diagnosi verso le varie forme di neuropatia e concorrono a fornire le indicazioni per le eventuali indagini genetico-molecolari.

L’esame elettrofisiologico del probando, sulla base dei dati disponibili in letteratura e dell’esperienza dei membri del Gruppo di lavoro, deve essere eseguito secondo i criteri sotto riportati.

  1. Lo studio delle fibre nervose motorie deve essere eseguito in almeno due (preferibilmente quattro) nervi degli arti superiori ed inferiori e deve comprendere il calcolo di:
  1. velocità di conduzione motoria massima (se possibile in due segmenti di ogni nervo);
  2. latenza distale;
  3. ampiezza del potenziale d’azione muscolare composto (CMAP, ottenuto con stimolazione sovramassimale e derivato con elettrodi di superficie);
  4. latenza minima dell’onda F (in almeno due tronchi nervosi).
  1. Lo studio delle fibre nervose sensitive deve essere eseguito in almeno due nervi degli arti superiori ed inferiori. Può essere effettuato con modalità orto od antidromica e deve prevedere il calcolo di:
  1. velocità di conduzione sensitiva (VCS) massima;
  2. ampiezza del potenziale d’azione sensitivo (SAP).

Per una corretta valutazione della velocità di conduzione è indispensabile conoscere la temperatura cutanea dell’arto esaminato, specialmente nel segmento distale dell’arto.

Tutti i parametri misurati (VCM, VCS, CMAP, SAP, latenza onda F) vanno confrontati con i dati normativi di riferimento, relativi a soggetti normali secondo le diverse fasce di età, che ogni laboratorio deve avere.

  1. Studio della conduzione attraverso i siti di entrapment, obbligatoria qualora vi sia il sospetto di HNPP. E’ indispensabile valutare:
  1. la conduzione nervosa in almeno tre siti di più frequente entrapment (nervo ulnare al gomito, nervo mediano controlaterale al polso - tenendo presente che una alterazione focale della conduzione in questo sito è molto sensibile ma poco specifica -, nervo peroneale al capitello fibulare);
  2. l’esistenza di un blocco parziale di conduzione delle fibre motorie.

I risultati delle indagini elettrofisiologiche orientano le successive indagini genetiche secondo i seguenti criteri:

  1. presenza o meno di alterazioni dei parametri della conduzione nervosa.
  2. entità del rallentamento della conduzione nervosa.

Per convenzione universalmente accettata in letteratura internazionale i valori di VCM agli arti superiori (n.mediano) costituiscono il criterio di suddivisione tra CMT1 e CMT2. La maggioranza degli Autori indica 38 m/sec come valore di discriminazione tra CMT1 (< 38 m/sec) e CMT2 (>38 m/sec).4,13,18,37 Nelle presenti linee guida si è seguita tale indicazione, utilizzata anche dal consorzio Europeo per la CMT.26 Valori di conduzione intermedi nei pazienti maschi e comunque valori più bassi di quelli delle femmine della stessa famiglia, suggeriscono la possibilità di CMTX 4,27 (cfr. flowchart A). Infine per poter formulare la diagnosi di malattia di Dèjèrine-Sottas i valori di VCM devono essere inferiori ai 12 m/sec.29

c) distribuzione delle alterazioni della conduzione nervosa: rallentamenti omogenei e simmetrici nei 4 arti e nei segmenti prossimali e distali dei nervi esplorati sono tipici di CMT1 e DSS; rallentamenti disomogenei, asimmetrici, più evidenti nei siti di entrapment, con eventuali blocchi di conduzione orientano verso l’HNPP 16,39,41 (cfr. flowchart A).

d) coinvolgimento delle fibre sia sensitive che motorie (CMT, DSS, HNPP). Se il coinvolgimento è esclusivamente a carico delle fibre motorie, in assenza di rallentamenti della VCM, si tratta verosimilmente della forma di CMT spinale.13,17

Gli elementi raccolti possono essere già sufficienti per richiedere la ricerca mirata della duplicazione e della delezione (vedi capitolo riguardante l’analisi genetico-molecolare). Se la ricerca di tali mutazioni risulta negativa è indicata la rivalutazione clinico-strumentale del paziente (e della famiglia) che può comprendere l’effettuazione dell’esame liquorale e della biopsia nervosa (vedi anche flowchart A e B).

L’esame del Liquor Cerebrospinale dovrebbe essere eseguito solo in casi selezionati. Nella CMT, HNPP e DSS la proteinorrachia può essere normale o moderatamente aumentata (in particolare nella DSS) 13,18,29 L’esame è utile per la diagnosi differenziale tra CMT1 e DSS nei confronti della CIDP (poliradiculoneuropatia demielinizzante infiammatoria cronica): in quest’ultima la proteinorrachia, aumentata in circa il 95% dei casi,2 può risultare particolarmente elevata o possono essere presenti bande oligoclonali. Inoltre, l’esame liquorale è indicato quando esista l’esigenza di una diagnosi sollecita non compatibile con i tempi necessari per l’indagine genetica; o se si verifica un brusco peggioramento nel decorso cronico di CMT (riportate eccezionalmente forme con sovrapposizione di CIDP).13,37

Anche la Biopsia Nervosa non è necessaria quando sia stata identificata la mutazione (duplicazione o delezione) nei casi di CMT1A e HNPP, ed è indicata solo in casi selezionati, o per la diagnosi differenziale con la CIDP (in cui può dimostrare una focalità delle alterazioni e la presenza di infiltrati infiammatori) e con altre neuropatie, o per confermare la presenza di alterazioni tipiche (ad es. i tomacula nella HNPP). In particolare è: a) fortemente raccomandata per i casi sporadici senza duplicazione o delezione prima di procedere ad ulteriori indagini genetico-molecolari; b) indicata per i casi di sospetta HNPP senza delezione e senza familiarità; c) indicata nelle forme ereditarie e sporadiche di neuropatia demielinizzante infantile senza duplicazione né delezione; d) utile nei casi familiari con incerta definizione del fenotipo elettrofisiologico (demielinizzante piuttosto che assonale), come può avvenire per la CMTX.

DIAGNOSI DIFFERENZIALE

La diagnosi differenziale si pone nei confronti di molte neuropatie a eziologia diversa e può risultare difficoltosa soprattutto nei casi sporadici o nei quali la familiarità non sia evidente.

In particolare per i casi sporadici di CMT1 (e DSS) la diagnosi differenziale nei confronti della CIDP e delle neuropatie demielinizzanti associate a gammopatie monoclonali di incerto significato (MGUS) può risultare problematica.

Nei casi di neuropatia demielinizzante grave ad esordio infantile senza duplicazione, esame del liquor e biopsia del nervo sono raccomandati per l’utilità nella diagnosi differenziale con le neuropatie disimmuni e alcune malattie dismetaboliche.

E’ spesso difficile la diagnosi differenziale tra casi sporadici di CMT2 e le neuropatie assonali croniche acquisite.35 Benchè età di esordio e piede cavo costituiscano un criterio differenziale utile, è necessario escludere cause tossiche e carenziali, non essendo disponibili test genetici. La neuropatia amiloidotica familiare, anch’essa ad eredità autosomica dominante, si differenzia dalla malattia di CMT tipo 2 per i segni preminenti di interessamento del sistema nervoso autonomo e delle sensibilità superficiali – che riflettono il coinvolgimento delle fibre amieliniche e piccole mieliniche – e per la maggior rapidità di progressione.

L’HNPP deve essere considerata tra le ipotesi diagnostiche in tutti i casi di mononeuropatia e di plessopatia acuta non dolorosa. L’HNPP va pertanto tenuta distinta dalla amiotrofia neuralgica sia nella sua forma sporadica (sindrome di Parsonage-Turner) che in quella, estremamente rara, ereditaria (HNA, localizzata sul cromosoma 17q).8,11

 

 

DIAGNOSI DIFFERENZIALE CON

ESAMI UTILI

CMT1, DSS

CIDP, MGUS immunofissazione, ricerca anticorpi anti-MAG, liquor, biopsia
Neuropatie demielinizzanti infantili CIDP,

neuropatie dismetaboliche

liquor, biopsia, RM encefalo, esami biochimici

CMT2

neuropatia amiloidotica familiare visita oculistica, ecocardiogramma, funzionalità renale, valutazione sistema nervoso vegetativo, biopsie (nervo, grasso periombelicale, mucosa rettale)

HNPP

mononeuropatie e plessopatie acute non dolorose idiopatiche, da entrapment, da compressione EMG: alterazioni multiple ai siti di entrapment;

biopsia nervosa

HNPP

amiotrofia neuralgica sporadica (sindrome di Parsonage-Turner) o familiare (HNA) (differenziati da: presenza o meno di dolore, fattori precipitanti)

CMT1, CMT2 = malattia di Charcot-Marie-Tooth tipo 1, tipo 2.

DSS = malattia di Dèjèrine-Sottas

CIDP = poliradiculoneuropatia demielinizzante infiammatoria cronica

MGUS = (neuropatie associate a) gammopatie monoclonali di incerto significato

HNPP = neuropatia ereditaria con predisposizione alle paralisi da compressione

 

L’ANALISI GENETICO-MOLECOLARE 5-7,11,21-24,26,31,40

IDENTIFICAZIONE DELLA DUPLICAZIONE (CMT1A) E DELLA DELEZIONE 17p11.2 (HNPP).

La presenza della duplicazione/delezione può essere dimostrata mediante diverse metodiche di genetica molecolare. Queste utilizzano sonde di DNA che riconoscono loci all’interno della regione 17p11.2 (a), oppure parte di sequenze omologhe, denominate CMT1A-REP, localizzate ai lati della regione e responsabili dell’evento di ricombinazione che porta alla duplicazione/delezione (b). Queste metodiche evidenziano la presenza di uno specifico frammento di giunzione che si forma in seguito alla ricombinazione (mediante elettroforesi a campi pulsati = Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE). oppure rivelano la duplicazione/delezione direttamente (ibridazione in situ fluorescente o FISH) o indirettamente mediante analisi quantitativa del dosaggio genico (Southern blotting e analisi dei microsatelliti mediante Polymerase Chain Reaction, PCR). Queste ultime due tecniche possono inoltre essere utilizzate per studiare la segregazione dei marcatori nei casi familiari di CMT e HNPP.

Le metodiche utilizzate hanno livello di informatività, complessità e costo che varia da tecnica a tecnica (vedi allegato A). (Il grado di informatività di un test corrisponde alla percentuale di casi in cui e’ possibile trarre una conclusione diagnostica univoca)

ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI

La ricerca di mutazioni puntiformi nei geni che codificano per le proteine mieliniche PMP22 (PMP22), P0 (MPZ) e per la connessina 32 (Cx32) non viene effettuata routinariamente sui pazienti con neuropatia, ma solo in seguito a specifiche indicazioni cliniche e strumentali in pazienti nei quali non siano state dimostrate la duplicazione o la delezione della regione 17p11.2.

I pazienti con CMT1 che non hanno la duplicazione (e non dimostrano trasmissione della malattia da maschio a maschio) dovrebbero essere analizzati in primo luogo per la presenza di mutazioni nel gene per la connessina 32 (Cx32). In caso di risultato negativo (o direttamente se vi è trasmissione da maschio a maschio), vanno ricercate mutazioni nei geni che codificano per le proteine mieliniche P0 (MPZ) e PMP22 (PMP22), o nel gene EGR2. I pazienti con HNPP senza delezione possono essere analizzati per la ricerca di mutazioni puntiformi del gene PMP22.

FLOWCHART A e B.

Sono state predisposte due flowchart per orientare l’iter diagnostico delle neuropatie ereditarie. La prima, flowchart A, parte dal fenotipo clinico, CMT o DSS in un caso e HNPP nell’altro, per poi seguire diverse direzioni a seconda del fenotipo elettrofisiologico e successivamente del dato genetico, a prescindere dalla conoscenza della modalità di trasmissione. Nei casi in cui la familiarità sia negativa, è opportuno rivalutare il quadro generale, completando le indagini nel probando ed eventualmente valutando direttamente i familiari alla ricerca della conferma della familiarità; se persiste il forte sospetto di neuropatia ereditaria, l’iter diagnostico procede nella flowchart in genere secondo le modalità della trasmissione dominante, nell’ipotesi che si tratti di un caso con mutazione di nuova insorgenza o di un caso in cui non sia possibile verificare la familiarità. I casi a trasmissione autosomica recessiva, limitati alla CMT, sono rari e attualmente non sono passibili di diagnosi genetica.

La flowchart B illustra un ipotetico percorso diagnostico molecolare partendo dai test più semplici ma a minore informatività per giungere a quelli più informativi (informatività =100%) ma anche più sofisticati e meno accessibili.

 

ALLEGATO A. METODI DI ANALISI MOLECOLARE

Metodi di analisi per la ricerca della duplicazione

(a) Nei pazienti con CMT1A, l’utilizzo su Southern blotting di sonde interne alla regione duplicata può rivelare la presenza di tre alleli distinti o di differenze di intensità (=dose) tra due alleli. La differenza d’intensità tra gli alleli nei soggetti eterozigoti viene stabilita sia per confronto visivo diretto sia mediante analisi densitometrica dei due diversi alleli con l’eventuale utilizzo di una sonda di riferimento. Questo studio richiede l’impiego di più sonde e può risultare non informativo in caso di omozigosi dei marcatori in una percentuale discreta di pazienti (20% ca).

Le sonde della regione CMT1A possono anche essere utilizzate per la FISH, analisi citogenetica dei nuclei in interfase che viene condotta sia con sonde all’interno della regione duplicata che con sonde di riferimento esterne alla regione duplicata (two-color FISH). Nei pazienti con CMT1A, la presenza di tre punti fluorescenti (spots) all’interno dei nuclei in interfase dimostra inequivocabilmente la presenza della regione duplicata. Tale metodica è informativa nel 100% dei casi ma richiede competenze ed apparecchiature specifiche per citogenetica e pertanto non è disponibile presso tutti i laboratori di diagnostica molecolare.

All’interno della regione duplicata sono presenti anche marcatori polimorfici (ad es. RM11GT e Mfd41) costituiti da sequenze semplici ripetute (microsatelliti), che possono essere analizzati mediante la metodica della PCR. Anche in questo caso l’analisi può rivelare la presenza di tre alleli distinti o differenze di intensità (=dose) tra due alleli. Benché lo studio mediante PCR sia, rispetto al Southern blotting, di più rapida ed economica esecuzione, l’informatività combinata di questi marcatori è comunque inferiore al 50% e questa metodica deve pertanto essere integrata con altre a maggiore informatività.

(b) L’analisi mediante Southern blotting con sonde localizzate all’interno delle sequenze omologhe CMT1A-REP che fiancheggiano la regione duplicata permette la dimostrazione del frammento di giunzione (3.2 kb) che si forma a causa dell’evento di ricombinazione. Tali sonde sono collocate all’interno della regione più frequentemente coinvolta (» 75%) nella rottura cromosomica e pertanto il loro utilizzo risulta informativo nella stessa percentuale di casi.

Infine, sia le sonde che identificano il frammento di giunzione tra CMT1A-REP distale e CMT1A-REP prossimale che quelle all’interno della regione duplicata possono essere utilizzate nell’analisi mediante elettroforesi a campi pulsati (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE). Questa metodica rivela i grandi frammenti di giunzione (le cui dimensioni variano da » 150 a » 500 kilobasi a seconda delle sonde utilizzate) generati dalla ricombinazione tra i due CMT1A-REP e ha una informatività del 100%. Si tratta tuttavia di una tecnica alquanto laboriosa e dispendiosa e non disponibile in tutti i laboratori. Inoltre, non può essere eseguita su campioni conservati di DNA, ma richiede preparazioni da sangue fresco.

Metodi di analisi per la ricerca della delezione

L’analisi si avvale delle stesse tecniche usate per la identificazione della duplicazione. La FISH e la PFGE sono, anche in questo caso, le metodiche più informative (100%) anche se più laboriose e costose. Le metodiche utilizzate evidenziano la presenza dello specifico frammento di giunzione associato alla presenza della delezione [PFGE (770/820 kilobasi) e Southern blotting convenzionale (7.8 kilobasi)] oppure rivelano la delezione direttamente (FISH) o indirettamente mediante analisi quantitativa del dosaggio genico (Southern blotting e analisi dei microsatelliti mediante PCR).

Metodi di analisi per la ricerca di mutazioni puntiformi

L’analisi è focalizzata sulle regioni genomiche codificanti (esoni) e sui confini esone-introne. La ricerca di mutazioni utilizza in prima istanza metodiche rapide di screening [Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), analisi della formazione degli eteroduplici] con una sensibilità dell’80% circa. L’analisi diretta della sequenza che viene generalmente eseguita successivamente a questi screening preliminari è maggiormente sensibile ma più costosa e non viene eseguita routinariamente.

 

ALLEGATO B. METODOLOGIA

Le presenti L.G. si conformano ai principi generali contenuti nel rapporto della FISM9 e sono redatte secondo le modalità previste dalla ANDEM1 per le raccomandazioni di pratica clinica. La procedura adottata è la seguente:

formazione di un Gruppo di Lavoro ad hoc (GdL) costituito con decisione assembleare in occasione della 2° Riunione del Gruppo di Studio del Sistema Nervoso Periferico (Spotorno 20-21 marzo 1997); sono entrati a farne parte esperti di diversa estrazione: neurologi, neurofisiologi clinici, neuropatologi, genetisti, esperti in bioetica;
revisione dei dati di letteratura disponibili; riunioni periodiche; discussione;
stesura di un 1° documento intermedio;
parere di un gruppo di lettura multidisciplinare individuato dal GdL: neurologi leader di gruppi attivi nel campo della diagnostica delle neuropatie periferiche; neurofisiologi clinici; neuropediatri; esperti in genetica medica; esperti in bioetica;
ritorno al GdL dei pareri forniti dal gruppo di lettura;
stesura di un 2° documento intermedio, proposto per approvazione assembleare alla 3° riunione del Gruppo di Studio del Sistema Nervoso Periferico (Belgirate 2-3 Aprile 1998);
parere formale del Gruppo di Studio SIN / SNO per le Linee Guida e gli Standard Operativi in Neurologia; revisione del testo, ora definitivo, alla luce delle modifiche proposte.
presentazione delle L.G. ai Consigli Direttivi delle Società di Neurologia (SIN, SNO, SINC), di Neuropsichiatria Infantile (SINPI), di Genetica (SIGU) e Patologia Clinica (AIPAC, SIBIOC) per l’approvazione ed adozione.
Il GdL resterà operativo in previsione delle necessarie attività di divulgazione, implementazione, verifica ed aggiornamento delle L.G. Fra i compiti prioritari esisterà quello di stabilire una relazione organica con gruppi e società scientifiche potenzialmente interessate.

Non esistono in letteratura precedenti esperienze di linee guida sull’argomento. Esiste una consistente letteratura su casi isolati ed una serie di lavori su casistiche, che sono stati sistematicamente rivisti. Per tutte le indicazioni fornite nelle presenti L.G. si è seguito il criterio della migliore evidenza possibile secondo la letteratura internazionale.

ALLEGATO C. DIAGNOSI MOLECOLARE: ASPETTI ETICI E PROCEDURALI 10,15,28

Nel caso della CMT1 e dell’HNPP l’analisi genetico-molecolare ha spesso il significato di perfezionamento diagnostico: diventa indispensabile qualora non vi sia altro modo di raggiungere una diagnosi di certezza; rappresenta l’unica via percorribile per lo screening prenatale e comunque in un soggetto non disponibile ad altri accertamenti; può venire richiesto in fase presintomatica e quindi a scopo predittivo. Le raccomandazioni per l’esecuzione del test tengono conto di questo specifico contesto (e non sono perciò estensibili ad altre malattie geneticamente determinate).

LA PROCEDURA

Il test va eseguito nell'ambito di strutture specializzate dove esistano competenze multidisciplinari (genetisti, neurologi, operatori sociali, psicologi, esperti in questioni etiche) e dove sia garantito un adeguato follow-up al paziente; se ciò non fosse possibile, deve essere comunque identificato un medico responsabile della presa in carico complessiva del paziente, in grado di svolgere in modo non occasionale tale funzione. Il laboratorio che esegue il test deve attenersi a standard di qualità rigorosi e dichiarati. La risposta deve essere fornita per iscritto ed indicare la metodica impiegata dal laboratorio e la relativa informatività.

L'INFORMAZIONE

Il paziente deve essere edotto che il test (o l'intero iter diagnostico se di questo si tratta) è mirato alla definizione di una malattia geneticamente determinata; deve conoscere le caratteristiche della malattia e la sua variabilità fenotipica, a maggior ragione nel caso di test presintomatico.

Deve essere informato, oltre che dell’esistenza del test e della possibilità di effettuarlo, del suo livello di accuratezza, delle modalità di esecuzione, delle possibili ricadute a livello personale e familiare dei risultati conseguenti. Il paziente va informato anche del fatto che il test molecolare non si può considerare predittivo della gravità clinica.14 Inoltre, deve essere messo al corrente dei supporti a lui garantiti dalla struttura di riferimento nella fase diagnostica e nella fase di follow-up.

IL CONSENSO

Per l'esecuzione del test è necessario il consenso informato dell'interessato; quando il test viene svolto nell'ambito di una serie di accertamenti, il consenso deve vertere non solo sul singolo test ma anche sull'iter diagnostico nel suo complesso. Se il test richiesto è svincolato da ogni altra indagine, e comunque quando non esistano le condizioni di una "presa in carico" del soggetto da parte di una struttura e/o di uno specialista di riferimento, il consenso va formalizzato per iscritto; la forma scritta è comunque sempre raccomandabile.

Nel caso dei minori, il consenso va richiesto al legale rappresentante: è tuttavia opportuno che anch'essi ricevano una informazione commisurata all’età e che in rapporto a questa possano condividere eventuali scelte.

LA RISERVATEZZA DEI DATI

Ogni aspetto delle indagini che portano alla diagnosi è coperto dal segreto professionale oltre che tutelato dalla vigente normativa sulla privacy. I campioni di DNA restano di proprietà dell'interessato.

Al fine di evitare situazioni problematiche, sono auspicabili accordi a priori perché il paziente sia disponibile ad estendere l'informazione prodotta ai propri parenti e, viceversa, perché questi non si debbano confrontare con una informazione indesiderata.

LA DIAGNOSI PRENATALE

E' augurabile che entrambi i genitori concordino sul test prenatale; in caso di conflitto, ogni sforzo deve essere fatto perché si raggiunga un accordo. Se il conflitto è insanabile, il parere decisivo spetta alla madre. L’opportunità del test prenatale va discussa con gli interessati in rapporto alle caratteristiche della malattia attesa e ai rischi indotti dalla procedura.

IL CONTESTO SPERIMENTALE

Quando il test genetico (oltre che altre procedure di potenziale significato diagnostico) viene effettuato per ragioni di ricerca, il soggetto che fornisce il consenso è libero di decidere se essere messo a parte del risultato o meno: tale opzione deve risultare per iscritto unitamente al consenso stesso.

IL CARICO ECONOMICO

Il test deve poter essere eseguito nell'ambito del S.S.N., quindi con carico economico diretto limitato o assente, quando ne esistano le indicazioni.

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Aggiornato il: 16 April 2001